浅谈ROS检测方法

活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)指来源于氧的自由基和非自由基，包含了超氧阴离子(O2·-)、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(·OH)、臭氧(O3)和单线态氧()等，由于它们含有不成对的电子，因而具有很高的化学反应活性。

在机体内，ROS的主要来源之一是线粒体内膜的呼吸链底物端，在线粒体中的电子传递链复合物将电子传递给O2的过程中，有一部分O2被还原，形成O2-或H2O2。其中，最为重要的是O2-，它是大部分的ROS的前体，主要由线粒体内膜呼吸链中的蛋白酶复合体Ⅰ、Ⅲ产生。这部分作为代谢副产物的ROS长期被当作损伤生物大分子的毒性分子，但近年来被认为在较低水平时作为一类信号小分子具有生理作用。另一个ROS的重要来源是NADPH化酶，其催化亚基被称为NADPH氧化酶2（NADPHoxidase2，NOX2/gp91phax），能够在细胞质膜上表达。这些酶能通过质传递电子产生ROS，可以大量存在于吞噬细胞，也在其他各种组织细胞中以较低水平普遍存在，参与很多膜受体下游信号激活。

ROS在细胞生命，应激和死亡中具介导作甩，并具不同浓度的ROS在其中起着戴然不同的作用，从而导致细胞命运的不同。因此，非常有必要对ROS的浓度或相对水平进行可靠的测量。

为研究ROS的生物影响，首先要知道它们的准确位置和浓度。然而，由于大多数氧自由基的不稳定性、短寿命和相互干扰，要实现上述所有目标并不容易，需借助于荧光染色法、色谱法、化学发光法、分光光度法，基于基因编码的荧光蛋白等手段。

荧光染色法

目前利用荧光染色法检测细胞内ROS最常用的是DCFH-DA荧光探针法。DCFH-DA（DichlorofluoresceinDiacetate，2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐）是一种可指示的探针，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不能通过细胞膜，因此探针很容易积聚在细胞内。细胞内的ROS能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，且绿色荧光的强度与ROS的水平成正比。在最大激发波长nm，最大发射波长nm处，使用荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等检测荧光信号。Rosup为活性氧阳性诱导药物，根据其荧光信号强度，可分析细胞内活性氧的真正水平。

色谱法

色谱法用于羟基自由基及其反应产物的分离和鉴定。·OH与特定的试剂反应，生成可通过色谱分析检测到的稳定化合物，其中通常使用液相色谱及其与质谱的组合。通常用于稳定自由基的试剂是苯甲酸，水杨酸和DMSO。水杨酸与羟基自由基反应生成的2,3-二羟基苯甲酸(2,3-DHBA)和2.5-二羟基苯甲酸(2,5-DHBA)通过HPLC并使用电化学检测器进行定量，证明此方法可用于体内测量羟基自由基。基于HPLC的方法已应用于许多反应系统和组织中的羟基自由基或抗氧化剂活性的检测。

化学发光法

硼酸盐可以与过氧亚硝酸根和H2O2反应形成单一稳定的酚类产品，用以定量监测细胞中OONO-和H2O2。将其与荧光团的连接，在与H2O2反应时可产生荧光产物，提供比其原型更有选择性和敏感性的检测。以MitoPY1探针为例，它是由一个化学选择性的硼酸盐基开关和一个线粒体靶向的鏻分子组成，后者可以将MitoPY1探针靶向线粒体，促进其与H2O2反应，产生MitoPY1ox，其荧光可在nm处检测到。

3,3’-二氨基联苯胺（DAB）是一种比色指示剂，旨在对ROS进行原位成像。DAB在过氧化物酶的催化下与H2O2反应，形成不溶性的棕色沉淀，可以在组织或细胞水平上进行显微成像。

分光光度法

分光光度法是检测ROS的悠久方法。它们基于自由基和氧化还原物质之间的反应而起作用，并且底物和产物之间在不同波长下的吸光度差异使自由基的半定量化成为可能。最常用的方法有细胞色索C(cytochromeC)的O2·-还原法和氮篮四唑(nitrobluetetrazolium,NBT)还原法。

基于基因编码的荧光蛋白法

基于荧光蛋白的氧化还原探针是通过结合荧光蛋白(FPs)和原核生物氧化还原敏感蛋白而设计的。重组蛋白通过质粒或腺病毒引入细胞，并靶向亚细胞器，从而显示某些区域的氧化还原状态。

氧化还原敏感绿色荧光蛋白（roGFPs）可在氧化性细胞器（内体、溶酶体和内质网）中被完全氧化，因此它们更适合于还原性环境，如细胞质、线粒体、细胞核和过氧化物酶体。roGFPs的荧光强度不会像氧化还原状态的变化那样迅速，更适合监测持久的氧化还原变化。

cpYFPOxyR重组蛋白（HyPer）可用于检测H2O2，已广泛用于多种细胞系和活体动物的研究，如拟南芥、酵母和小鼠等，为细胞内动态变化和过氧化氢的实时研究提供了有力工具。需要注意的是HyPer使用时要监测局部或全身的pH变化。