作者：静小
20世纪50年代叶酸抗代谢物甲氨蝶呤以儿童急性淋巴白血病为适应症获批上市，开始恶性肿瘤化疗时代。随后的60多年，肿瘤化疗和靶向治疗取得了巨大的发展，但是叶酸类抗代谢药物仍以甲氨蝶呤为主，直至年培美曲塞的出现，才填补这一空白。甲氨蝶呤对肿瘤细胞的选择性差，临床呈现较强毒性，尤其是小肠黏膜和骨髓等生长旺盛的组织，人们致力于提高叶酸抗代谢药物的选择性。其中普林斯顿大学有机化学家Taylor教授从辅酶的化学作用入手，穷其一生合成了数百个结构多样的类似物，研发出可同时作用于叶酸代谢路径上的5个酶系的培美曲塞，疗效显著优于甲氨蝶呤，标志着叶酸抗代谢药物取得实质性进展。
1先导化合物的发现
四氢叶酸是一类化学载体，其N5或（和）N10原子上连接了不同氧化态的被转移的一碳基团，形成不同形式的辅酶分子（5-CHO-THF、5-CH3-THF、10-CHO-THF等），从而参与叶酸途径转移一碳基团的各种生化反应。
分析发现这些辅酶分子都具有蝶啶-对氨基苯甲酸-谷氨酸的结构，区别只是N5和N10的连接基团，因而设想变换的位点应集中在N5和N10处。为此，将N5和（或）N10用碳原子代替，保持其余结构不变，探索这样的化合物对多种一碳转移酶的抑制作用。从而合成了一系列衍生物，并测定了对二氢叶酸还原酶（DHFR）的IC50和胸苷酸合成酶（TS）的IC50。
R1或R2由氨基取代时对DHFR活性较高，但是对TS几乎没有活性，R1或R2为羟基时，对DHFR和TS均没有活性。提示将四氢叶酸的N5和N10氮原子换成碳的简单置换是无效的。
进一步探究衍生物1～4与叶酸聚谷氨酸合成酶（FPGS）的结合力Km，并与FPGS的底物H4PteGlu进行比较，见下表。提示化合物4与FPGS结合力接近天然底物H4PteGlu与Km的结合力。
评价化合物4对多种瘤株的抑制活性发现，提示化合物4对多种人肿瘤细胞的抑制作用优胜于甲氨蝶呤，见下表。因此以化合物4为先导化合物。
25-去氮四氢叶酸及其衍生物
为了分别考察四氢叶酸的N5和N10被碳原子替换对活性的影响，将化合物4恢复N10，合成一系列5-去氮四氢叶酸，并利用离体人淋巴白血病细胞评定其活性，见下表。
结果显示，化合物5的活性高于4，也高于N10-取代化合物（6～8），体积较大的乙酰基（7）活性显著下降。当在白血病细胞的培养基中加入过量的次黄嘌呤时，可解除化合物5对细胞的抑制作用，而加入胸腺嘧啶时不影响对细胞的抑制，提示5干预了嘌呤生物合成的环节，与化合物4相同。化合物5（和4）的差向异构体分离后两个单体的活性接近，提示C6的构型对活性没有影响。
进一步探究了化合物5对FPGS结合力的Km，见下表。
化合物5的Km低于4，说明更强的结合底物，一级速率常数也是4的5倍。另外化合物5对小鼠移植性乳腺癌和淋巴肉瘤的抑制剂量未显示显著毒性，提示具有选择性抗肿瘤作用。
3消除手性结构（C6）
消除手性的简单方法是将C6换成平面性的sp2杂化的碳原子。合成了化合物9和10，但这两个化合物不稳定，在空气中容易发生氧化脱氢，芳香化成化合物3。
故选择打开四氢吡啶环，母核变成单环嘧啶经碳链与苯环连接，合成了一系列衍生物，见下表。结果显示，11～16的活性都低于化合物4（IC50=0.02μmol·L-1），表中活性最强的11，其活性换算为摩尔浓度IC50=2μmol·L-1。
另一种消除手性的方法为去掉C7原子，合成开环衍生物17，17对小鼠白血病L-细胞抑制活性IC50=0.μmol·L-1，略低于化合物4（IC50=0.μmol·L-1）。开环衍生物将是进一步优化的新方向。
随后以开环物17的结构为中心，变换取代基和片段，合成一系列衍生物，并探究对L-细胞抑制活性，见下表。
化合物17对L-细胞的抑制活性与4接近，作用机理表明，培养液中加入过量的黄嘌呤可逆转抑制活性，而且加入胸腺嘧啶不能解除抑制，提示17的作用环节是阻断嘌呤合成；17对从L-细胞中分离的甘氨酰胺核苷甲基转移酶（GARFT）的抑制活性（Ki=0.38μmol·L-1）只低于化合物4活性的3倍，提示开链的17没有改变作用机制。化合物18抑制L-细胞活性强于17，但机制研究表明其作用环节是抑制二氢叶酸还原酶，而不是GARFT。苯基被噻吩置换（21和22），仍然保持活性，而且作用环节仍是GARFT。
4结构确定
Taylor对上述设计思路中合成的多个目标物进行构效关系分析：（1）碳原子置换N5氮原子是抑制GARFT的关键因素；（2）2-氨基嘧啶-4-酮是必需的母核；（3）在四氢吡啶与苯环之间的连接基至少需要两个原子间隔；（4）苯环可用各种五元或六元杂环置换，仍保持活性；（5）刚性的双环是必要的片段，去除C7形成的柔性开链化合物虽然有抑制GARFT作用，但对动物体内肿瘤的抑制作用减弱；（6）去除C5的开链化合物失去活性；（7）与嘧啶稠合的环不宜为芳香环；（8）嘧啶环的C6连接的NH2或稠合环的NH是必需的基团；（9）化合物被聚谷氨酸化是抑制癌细胞的重要步骤，应是叶酸聚谷氨酸合成酶的良好底物。
第7条中的“与嘧啶稠合的环不宜为芳香环”主要是参考N5,N10-二去氮叶酸的无活性得出的结论。研究者又从有机化学的视角对其进行分析：并合的吡啶环具有缺电子性，偶极矩2.2D，负极在N端，亲电试剂与吡啶的N发生作用。而吡咯环作为芳香环具有富电子性，偶极矩1.7D，负极在C原子上，亲电基团与吡咯的C发生作用。
Taylor因而设计了嘧啶并吡咯的杂环与乙苯甲酰谷氨酸片段相连（25），该化合物既保持了稠合环的刚性结构，也提供了参与结合的NH基团，还满足上述构效关系的要求。
对化合物25进行活性评定：（1）对小鼠L细胞的抑制活性IC50=0.μmol·L-1，人CCRF-CEM淋巴白血病细胞IC50=0.μmol·L-1；（2）培养液中加入亚叶酸或者胸腺嘧啶与黄嘌呤都能解除抑制作用，说明25的抗肿瘤作用是抑制叶酸代谢的结果；（3）是胸苷酸合成酶竞争性抑制剂，Ki=0.34μmol·L-1；（4）不抑制GARFT，因为加入黄嘌呤不能解除抑制，但聚谷氨酸化后是GARFT抑制剂；（5）是叶酸聚谷氨酸合成酶的强效底物，Km=0.2μmol·L-1，显著低于氨基蝶呤的Km=21μmol·L-1；（6）一级速率常数相对值为（叶酸为），甲氨蝶呤为0.9，氨基蝶呤为10.1，化合物4为32，故25是非常强效的胸苷酸合成酶抑制剂；（7）聚谷氨酸化后是二氢叶酸还原酶抑制剂、是氨基咪唑酰胺核苷酸甲基转移酶（AICARFT）抑制剂、是C1-四氢叶酸合成酶（C1-THF）抑制剂；（8）对缺失胸苷激酶和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的小鼠白血病腹腔注射12.5～mg·kg-1连续8天，显示有良好治疗效果和较宽的安全窗口。命名为培美曲塞，与历来共同深入开发，进入临床试验。
5小结
Taylor教授在硕士期间就主要研究黄蝶呤类衍生物的合成，对杂环化合物有浓厚的兴趣，后来，也出于兴趣与好奇，开始着手研究合成蝶啶和叶酸类似物，培美曲塞最终设计也是基于有机化学分析的结果。由于扎实的合成功底，Taylor教授合成了多个类似物用于构效关系研究。礼来则主要负责生物活性评定，反馈结果，进一步设计化合物。培美曲塞的研发也是大学和企业合作成功的典范。
参考文献
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