英国帝国理工大学的ChunchingLi（共同一作），欧阳礼亮（共同一作），JamesArmstrong（共同通讯）和MollyStevens（共同通讯）近期在TrendsinBiotechnology期刊上发表了关于梯度生物材料制备的综述--“AdvancesintheFabricationofBiomaterialsforGradientTissueEngineering”
Highlights：最近使用梯度生物材料复制关键的发育过程或功能角色的组织工程方案的数量激增。增材制造的最新进展（例如3D生物打印，微流体技术）已导致自下而上的梯度生物材料制造中结构的复杂性增加。越来越多的报告正在寻求使用施加力来重新分配均相系统的组件，以制造具有良好积分梯度的生物材料。少数近期研究通过控制水凝胶交联过程中的温度或光照来制造梯度生物材料。最近的报道表明，通过使用基于温度，光或扩散的机制对预制的水凝胶或固体支架进行后改性，可以制造出梯度生物材料。
背景
天然组织和器官表现出一系列的空间梯度，从胚胎发育过程中的极化神经管到关节关节处存在的骨软骨界面。这些异质组织中强大的结构-功能关系激发了对可在工程组织中复制生理梯度的方法开发的深入研究。在这篇综述中，作者考虑了天然组织中存在的不同梯度，并讨论了它们在功能组织工程中的至关重要性。在此基础上，作者将现有的制造方法整合为四类：增材制造，组件重新分配，受控相变和后改性。并通过最近的示例进行了说明，突出了该领域的突出趋势，并概述了梯度制造的一组标准和前景。
图1.四种梯度构建策略
增材制造
增材制造是梯度制造的一种直观方法，其方法包括顺序分层，3D打印，受控流体混合和静电纺丝。
图2.增材制造梯度材料结构
（A）骨软骨组织使用间充质干细胞进行工程处理，该细胞接种在具有低，中和高负荷矿化肽（R5）的连续分层支架上。图像显示苏木精和曙红（H＆E），vonKossa和组织切片的Sirius红染色。（B）具有组成梯度的3D打印支架，使用微流体打印头在挤出前可控地混合溶液组分。（C）（i）使用基于阀的流动聚焦微流体装置制造孔隙率具有建筑梯度的支架，以产生具有可调气泡大小的明胶和纳米羟基磷灰石（nHAP）复合泡沫。使用微计算机断层摄影术对所得的（ii）多层和（iii）梯度多孔材料进行3D重建。（D）（i）由两种不同的可生物降解的聚（氨基甲酸乙酯尿素）（BPUR）纤维制成的具有组成梯度的电纺支架。（ii）跨随机和对齐的梯度支架的不同区域的扫描电子显微照片。
组件的重新分布
组件的重新分布方法是通过对流拉伸，浮力，磁场或电场通过受控的混合，从最初的均匀分布中产生梯度。
图3.组件的重新分布方法构建梯度材料结构
（A）（i）通过颗粒对流形成的糖颗粒（灰色）的梯度将具有孔径在结构上梯度的支架作为模板。在添加并交联包含季戊四醇（PE），癸二酰氯（SC）和聚（ε-己内酯）二醇（PCL）的聚合物前体溶液（蓝色）后，将模板溶解，并在其中接种人胰岛（绿色）产生的毛孔。（ii）在整个支架中保留的具有不同模板大小范围的人类胰岛的数量。（B）（i）骨软骨组织，使用人间充质干细胞（hMSC）负载明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶进行工程改造，并具有浮力以形成与甲基丙烯酸肝素复合的骨形态发生蛋白2（BMP-2）的形态发生梯度。（HepMA）。所得组织用（ii）茜素红S染色以显示矿化帽的存在，以及（iii）阿尔辛蓝染色以可视化硫酸化糖胺聚糖的分布。（C）（i）在电场作用下，富含β-折叠的丝素蛋白纳米纤维（BSNF）通过水凝胶前体的迁移而产生的细胞支持性梯度生物材料。（ii）梯度，载丝的GelMA水凝胶均分为四个区域（称为MGH-M1，MGH-M2，MGH-M3，MGH-M4）。在这四个区域上进行的压缩测试表明，压缩模量存在机械梯度。（iii）在无定形丝素蛋白纳米纤维（ASNF）水凝胶和梯度丝素蛋白纳米纤维（GSNF）不同区域成骨分化28天后，间充质干细胞中Runt相关转录因子2（RunX）和骨钙蛋白（OCN）的基因表达）水凝胶。*P≤0.05，**P≤0.。缩写：BMSC，骨间充质干细胞
受控的相变方法
受控的相变可以导致从均质的起始材料形成梯度，通常使用逐步暴露于热或光的情况。
图4.受控的相变方法构建梯度材料结构
（A）（i）使用梯度光掩模制备渐变光可交联生物材料。（ii）对所得材料进行光学相干弹性成像和（iii）孔径测量，分别测量机械梯度（刚度）和建筑梯度（孔隙度）。（iv）封装在梯度GelMA水凝胶中的脂肪干细胞的形态。（B）（i）通过在热梯度下对淀粉和聚乙烯醇（PVA）复合水凝胶进行冰模板处理制成的支架。（ii）如通过（iii）扫描电子显微照片的图像分析所确定的，所得的复合材料在孔宽度上显示出结构梯度。（ii）中的节号指的是从（iii）所示区域获得的测量值。
后改性方法
后改性涉及在预制材料上呈现梯度，通常是通过受控的组分扩散或光图案化来实现的。
图5.后改性方法构建梯度材料结构
（A）（i）通过将双功能交联剂和信号量3A（Sema3A）依次扩散到Matrigel水凝胶中制备的梯度生物材料，并用于体内植入。（ii）荧光图像显示已经迁移到梯度水凝胶不同区域的Nestin+（绿色）和双皮质素阳性（DCX+；红色）细胞的分布。（B）（i）通过HAV和RGD肽的顺序光致交联将正交梯度图案化为降冰片烯官能化的透明质酸（NorHA）水凝胶，并使用滑动光罩控制曝光。（ii）用若丹明标记的RGD（红色）和荧光素标记的HAV（绿色）对正交梯度进行荧光成像。（iii）显示正交梯度调节Sox9的表达（蓝色）和聚集蛋白聚糖（紫色）的合成。指示的值基于标准化强度。
梯度生物材料制备标准
本综述中讨论的方法各有其优缺点（表1）。考虑到这些因素，在设计用于梯度组织工程的制造策略时应采用几个原则。
第一个标准是重新创建生物学相关的资料。通常由顺序分层方法形成的阶梯式过渡可能适合某些组织工程场景，例如骨软骨组织中的骨-软骨界面。但是，连续过渡与大多数自然系统具有更大的相关性，从而可以改善负载传递，并避免出现机械不稳定或不包含单元的界面。
第二个标准是生成复杂梯度的能力。许多策略（例如使用重力或浮力的策略）仅限于形成单个线性梯度。相比之下，自然系统通常会沿不同的结构轴（例如，神经管中的背腹和前后图案）或非线性结构（例如，血管壁的径向过渡）表现出梯度。这些系统可能会受益于诸如3D打印之类的方法或多种技术的组合所提供的更大的设计灵活性。可以设想其他收敛方法，例如3D打印过程中的冰模板梯度或通过顺序磁场吸引和分级光交联形成双重梯度的方法。
第三个标准是产生动态梯度的能力。天然系统在形态发生素梯度剖面中表现出动态变化，特别是在发育的不同阶段。这是基于生物材料的策略的主要挑战，该策略通常限于简单的缓释形态发生剂梯度。细胞分泌的酶已被用于响应表型变化而降解材料，并且可以使用类似的方法来释放形态发生剂梯度，以适应组织的发育和成熟。
第四个标准是无障碍设备的使用。协议的广泛采用可能会因某些技术（例如生物打印，微流体技术，双光子激光扫描）的专业知识和高昂的成本而受阻。通过使用标准实验室设备（例如离心机），发布详细的规程文件以及专用技术（例如梯度仪）的商业化，可以实现更大的可及性。
第五标准是系统的多功能性。使用单个材料，分子或组织演示了许多渐变制造“平台”。但是，可以更广泛地应用于不同系统的技术将能够满足更广泛的用户群的需求。在这方面，理想地，梯度制造不应受到特定材料特性（例如，光响应性，粘度，磁性）的约束。
第六条系统的可重复性和鲁棒性。在所报告的条件下，任何科学方法均应具有可重复性；但是，梯度制造不限于狭窄的参数空间也很重要。理想情况下，标准化协议应用于制造，其关键质量属性用于评估系统处理变更的容忍度。这与最后一个标准相关：系统可伸缩性和吞吐量。应始终评估的关键工艺变化是缩放：所选制造平台是否能够大规模生产梯度材料？在这方面，高度自动化，快速且可重现的系统通常将实现转化应用所需的高通量制造。
表1各梯度制备方法优缺点
总结
组织工程界完全专注于开发可重新创建天然组织的复杂体系结构的方法。在这里，作者概述了制造天然组织中存在的不同梯度的方法：细胞，成分，建筑，机械和形态发生素。作者已经基于不同的梯度制造策略的基本原理提出了一种新的分类系统：增材制造，组件重新分配，受控相变和后改性。本综述中提出的许多研究都集中在骨软骨组织工程上，其中梯度生物材料用于体外骨骼和心脏组织工程以及体内神经再生。在考虑目标组织和应用的特定要求之后，应选择和调整这些不同的方法。新方法的不断探索，为此，作者提出了一套理想的梯度制备标准：产生生物学相关，复杂和动态梯度的能力，广泛使用的设备的使用以及系统的多功能性，可重复性和健壮性。作者希望这篇评论会帮助并激发那些寻求开发新的梯度生物材料制造方法的人，以及那些将现有技术应用于工程梯度组织的人。
参考文献
LiC,OuyangL,ArmstrongJPK,etal.AdvancesintheFabricationofBiomaterialsforGradientTissueEngineering[J].TrendsinBiotechnology,.
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