目的
分析尿石症患者血清与尿液的氨基酸代谢轮廓，寻找疾病相关的差异生物标志物，为临床早期筛查诊断提供可靠依据。方法
病例对照研究。收集年2月至年10月福建医院泌尿外科确诊的74例尿石症患者（年龄20~82岁，男41例，女33例）和同期健康体检中心的35名健康对照者（年龄22~80岁，男20名，女15名）的血液与尿液样本。采用基于GC-MS的代谢组学研究策略，分别对患者与健康对照者的血清和尿液氨基酸水平进行分析，采用主成分分析与正交偏最小二乘-辨别分析（OPLS-DA）的多元统计分析方法进行建模，选择OPLS-DA模型的变量重要性投影值1与t检验的P0.05来筛选差异氨基酸代谢物，通过受试者工作特征（ROC）曲线分析和二元Logistic回归分析推断潜在标记物的诊断效能。结果
研究筛选出丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸和甘氨酸等5种氨基酸代谢物在尿石症组与对照组的差异具有统计学意义（P0.05），且与7条代谢通路相关联。将血清丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸和尿液甘氨酸、天冬氨酸组合成联合标志物组，其ROC曲线下面积为0.，敏感度为78.0%，特异度为96.4%。结论
共发现血清和尿液中的5种氨基酸可作为尿石症早期筛查诊断的生物标志物，为尿石症的分子基础研究提供一定的实验依据。正文尿石症（urolithiasis）是一种泌尿外科常见病，具有发病率高、复发率高的特点［1］，因此采取有效的预防措施并进行早期诊断治疗至关重要。但目前尿石症的诊断主要依赖具有放射性的影像学检查，缺乏高灵敏度、高特异度的可靠标记物用于早期快速筛查诊断。尿石症的病因与饮食习惯、生活方式、遗传代谢等因素有关，但确切的病理生理机制仍有待阐明。有研究指出，代谢因素与尿结石形成关系密切，大多数尿石症患者常伴发多种代谢性疾病，如高血压、痛风、糖尿病、心血管疾病等［2,3,4］。代谢异常的本质就是疾病发生发展的过程，在疾病的干扰下，代谢物质在机体的合成、转运、吸收、代谢的过程中出现异常，从而出现代谢物质消耗或堆积。因此，研究代谢物与尿石症的联系，对尿石症预防与诊断治疗以及寻找其发病机制具有重大意义。氨基酸及其代谢物是合成多肽和蛋白质的结构基石，在机体中发挥着至关重要的生物学作用［5］，是机体生长发育最重要的代谢物质之一。氨基酸通过参与基因表达和蛋白磷酸化调节，调节蛋白质周转、酶活性和离子通量，影响细胞信号和炎症反应，负责维持器官和体内蛋白质的稳态。在病理条件下，氨基酸的代谢过程和浓度水平可能会发生改变。因此，通过监测氨基酸代谢的动态变化，可以更好地了解疾病进展及其相关机制［6,7］。Primiano等［8］通过超高效液相色谱-质谱联用技术发现，肾结石患者尿液中的α-氨基丁酸、天冬酰胺、乙醇胺、异亮氨酸（isoleucine，Ile）、甲硫氨酸（methionine，Met）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、丝氨酸（serine，Ser）、色氨酸（tryptophan，Trp）和缬氨酸（valine，Val）水平低于健康对照组。Atanassova等［9］采用高效液相色谱法分析36例结石患者尿液氨基酸的排泄情况，发现约50%患者尿液中含有较低的Ser、甘氨酸（glycine，Gly）、牛磺酸和亮氨酸（leucine，Leu）。由此可见，氨基酸代谢与尿石症的发生发展存在紧密联系，并推测尿石症患者体内可能存在某些氨基酸代谢紊乱。由于代谢组学技术具有准确定量检测体液或组织中的微量代谢物的特点，近年来，基于代谢组学研究策略的氨基酸代谢研究已经广泛应用于儿童炎症性肠病、卵巢肿瘤、强直性脊柱炎等疾病中［10,11,12］。氨基酸代谢轮廓的检测主要采用核磁共振技术、液相色谱-质谱联用技术和气相色谱-质谱联用技术（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）等。由于GC-MS技术的稳定性、可重复性、选择性及其成熟的代谢物数据库，已成为代谢组学研究中效率最高、重现性最好的分析平台之一，已广泛应用于不同类型生物样本中氨基酸的分析［13,14,15］。且GC-MS在一定程度上避免了液相色谱-质谱联用技术常见的问题，如基质效应以及共洗脱化合物对离子的抑制等，从而实现了更好的色谱分辨率［16,17,18］。本课题组在前期成功建立了血清氨基酸GC-MS检测平台［19］，本研究进一步扩大样本类型，拟应用该平台检测尿石症患者和健康对照者的血清和尿液氨基酸代谢轮廓，采用代谢组学策略监控尿石症患者体内血清和尿液的氨基酸代谢变化，筛选潜在生物标志物，为阐明其病理生理学机制提供证据并为临床早期诊断治疗提供可靠依据。对象与方法
一、对象
收集年2月至年10月在福建医院泌尿外科就诊的74例尿石症患者和体检中心的35名健康对照者。所有患者均根据欧洲泌尿学协会指南［20］在福建医院泌尿外科通过CT或超声进行诊断，均为首次患病且未进行外科治疗。排除妊娠、癌症、糖尿病、高血压和肾功能不全以及其他可能与氨基酸紊乱相关疾病的患者。对照组由同期实验室检查结果正常的健康志愿者组成。随机数表法抽取各组80%的样本组合为训练集（59例患者和28名健康对照者），其余样本归为测试集（15例患者和7名健康对照者）。对尿石症组与健康对照组的年龄、性别和BMI指数、血糖、血肌酐等代谢指标进行t检验，其差异均无统计学意义（P0.05），2组参与者的基本信息如表1所示。
表1尿石症患者与健康对照者的基本信息
所有研究对象均采集清晨空腹静脉血2ml于分离胶促凝管，取10ml清晨中段尿于无菌管。为了防止降解，所有样本在采集后1h内以×g离心10min，将上清液分装并于-80℃冰冻保存。研究所涉及血清及尿液样本均经福建医科大学伦理委员会审定［（）福医伦理审字第（）号］。
二、仪器与试剂
A-7B气相色谱-质谱仪（美国Agilent公司）；2.0ml玻璃瓶（美国PaloAlto公司）；超纯水仪（德国Millipore公司）；BPD分析天平（德国Sartorious公司）；3-30K高速离心机（德国Sigma公司）。
17种氨基酸的混合标准溶液：丙氨酸（alanine，Ala）、精氨酸、天冬氨酸（asparticacid，Asp）、胱氨酸（cystine，Cyss）、谷氨酸（glutamate，Glu）、赖氨酸、Leu、Ser、苏氨酸、酪氨酸（tyrosine，Tyr）、Val、组氨酸、Ile、Met、Gly、Phe和脯氨酸（proline，Pro）。除Cyss浓度为μmol/L，其他浓度均为μmol/L，均购自美国Sigma-Aldrich公司。单氨基酸标准品：Trp、半胱氨酸、谷氨酰胺（glutamine，Gln）、13C3-Ala、13C3-Ser、13C6-Tyr和13C6-Phe（加拿大TorontoResearchChemicals公司）；乙腈、无水乙醇、异辛烷（色谱纯，德国Merck公司）；氢氧化钠、氯苯丙氨酸（分析纯）、盐酸（优级纯）（北京国药集团有限公司）；吡啶（纯度99.8%，上海阿拉丁公司）；氯甲酸异丁酯（isobutylchloroformate，IBCF）（分析纯，上海安谱公司）。
三、标准溶液配制
分别准确称取适量Trp、半胱氨酸和Gln，各加入0.1mol/L盐酸，配制成浓度为μmol/L的标准溶液。用0.1mol/L盐酸作为溶剂，将上述标准溶液与17种氨基酸混合标准品配制成μmol/L混合标准溶液（Cyss浓度为μmol/L）；再用0.1mol/L盐酸稀释成7个不同浓度（1、5、10、25、50、和μmol/L，Cyss对应浓度为0.5、2.5、5、12.5、25、50和μmol/L）的系列混合标准溶液，于4℃保存。
四、血清样本前处理
血清样本在室温下解冻后离心，吸取上清液依次进行蛋白沉淀、加入氯苯丙氨酸作为内标（internalstandard，IS）、加入IBCF衍生化［21］后，置于2ml样品瓶，待GC-MS分析。具体步骤可参考本课题组前期建立的血清氨基酸GC-MS分析方法［19］。
五、尿液样本前处理
尿液样本在室温下解冻30min，立即在×g4℃条件下离心5min。在2.0ml的小瓶中，将μl的上清液和μl的超纯水、0.1mg/ml氯苯丙氨酸溶液（即IS）混合，然后用μl无水乙醇提取代谢物。为碱化并催化反应，将μl的7mol/L氢氧化钠溶液和μl的吡啶溶液先后放入瓶中。与50μl的IBCF混合后，充分摇动小瓶5min，让释放出的二氧化碳从小瓶中逸出。随后，将溶液与μl异辛烷混合，摇匀后静置约10min。最后，收集μl衍生化上清液进行GC-MS分析。
六、GC-MS条件
色谱柱和离子源条件均参考本课题组前期建立的血清氨基酸GC-MS分析方法［19］。
七、统计学分析
1.数据预处理：使用ChemStation软件（美国安捷伦公司）进行峰处理并将血清样本色谱图上的各个峰面积与IS的峰面积标准化，再进行归一化处理。另外，将尿液样本的峰面积与IS和肌酐的峰面积标准化，再进行归一化处理。
2.多变量模式建模：采用SIMCA-P14.0软件（瑞典Umetrics公司）进行主成分分析（principal
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