背景：酒石酸伐尼克兰是Chantix?中的活性药物成分(API)。该药物用于辅助戒烟。已在制剂中鉴别出存在形成N-亚硝基伐尼克兰的可能性。为确保酒石酸伐尼克兰制剂(Chantix?)和原料药的安全性和质量，监管机构开发并验证了一种方法，用于测定是否存在伐尼克兰亚硝基-药物成分相关杂质(NDSRI)。
伐尼克兰NDSRI的结构如下图1所示。
结论：开发并验证了反相LC方法法联合HRMS检测用于Chantix?制剂和伐尼克兰原料药中伐尼克兰NDSRI的测定。使用辉瑞Chantix?(1mg)制剂处方中的安慰剂片剂验证该方法。建议在用于其它酒石酸伐仑克林制剂检测前进行确认或再验证。方法的检测限(LOD)、定量限(LOQ)和范围总结如下：
该方法的检测限和定量限分别0.2ppm和1.0ppm，相对于常见的7种亚硝胺杂质的定量限要求0.0ppm，方法的灵敏度差异0倍以上。这与化合物本身的结构相关，一方面得到的N-亚硝基伐尼克兰的化合物极性较大，无挥发性，难用GC-MSMS的方法，只采用LCMS方法。另一方面与N-亚硝基伐尼克兰的化合物分子大小有关，只探索到了这个定量限，没有再继续研究，也许已经在化合物限度的充许范围。
具体方法操作：
目的：开发并验证了该方法，以定量分析Chantix?制剂或伐尼克兰原料药中的伐尼克兰亚硝基-原料药相关杂质(NDSRI)。
原理：采用反相色谱法从酒石酸伐尼克兰中分离伐尼克兰NDSRI，并通过高分辨率和高质量准确度(HRAM)质谱仪进行检测。通过监测质子化杂质离子的准确m/z值实现高灵敏度检测。通过比较样品提取离子色谱图中伐尼克兰NDSRI的峰面积（m/z公差为±15ppm）与外标校准中伐尼克兰NDSRI对照品的峰面积进行定量。试剂：N-亚硝基伐尼克兰对照品（Clearsynth目录CS-O-或同等产品）甲醇，LC/MS级（FisherA-4或同等产品）
水，LC/MS级或同等产品
甲酸，LC/MS级（FisherA-50或同等产品）
流动相A：水、0.1%甲酸；流动相B：甲醇、0.1%甲酸稀释剂和空白：甲醇
标准品储备液制备精密称取10±mg伐尼克兰NDSRI对照品，转移至mL容量瓶中。用甲醇稀释至刻度，用搅拌棒混合直至溶解，一式两份。标记为储备标准品#1和储备标准品#2。
中间储备标准品A将适当体积的各标准品贮备液转移至单独的容量瓶中，以达到0ng/mL的目标浓度。用甲醇稀释至刻度。
中间储备标准品B(ng/mL)分别量取5.0mL各中间贮备标准品A，置于单独的50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
工作标准品和QC标准品制备液(1ng/mL)移取1.0mL等份体积的各中间贮备标准品B，置于单独的mL容量瓶中，并用甲醇稀释至刻度。指定一个标准品作为工作标准品，另一个作为QC标准品。每日新鲜制备。
样品制备精密称取25mg原料药，定量转移至50mL容量瓶中。用甲醇稀释至刻度，并用搅拌棒和板混合溶液直至完全溶解。采用0.22μmPVDF针头式过滤器过滤溶液，并将过滤后的样品转移至HPLC小瓶中，用于LC/MS分析。
制剂样品制备粉碎适量片剂，使甲醇中API的目标浓度为0.5mg/mL，然后转移至15mL玻璃离心管中。加入适量的甲醇，并使用涡旋混合器混合约1分钟。使用机械振荡器振摇样品40min。
提取后，以rpm离心样品15min。使用以下过滤器过滤上清液，将0.22μmPVDF针头式过滤器过滤至hplc小瓶中，用于LC/MS分析。
制备了对应的N-亚硝基伐尼克兰对照品，使用外标的方式进行杂质定量。样品处理简化了，没有详细的描述制剂的样品处理。也许与N-亚硝基伐尼克兰杂质本身稳定有关，没有特别的一些样品处理要求，在下述的方法中只要求在4-8度保存进样。
方法参数：
HPLC的方法比较常规和简单，说明活性成分与杂质可以很好的得到分离。质谱采用了双离子SIM的方式，化合物MS,提取和的碎片MS，专属性高。
进样序列
·在序列开始时至少进样一次空白（使用稀释剂）
·连续6次进样工作标准品
·在进样任何样品之前，进样QC标准品
·每进样6次样品，在序列结束时进样一次QC标准品。
示例：
系统适用性·工作标准品溶液前6次进样的
伐尼克兰NDSRI峰面积的%RSD(n=6)不得过10%。
·QC标准品的%回收率应介于85-%之间。
数据处理·使用提取离子色谱图(EIC)中m/z公差为±15ppm的伐尼克兰NDSRI峰面积进行定量。待提取的伐尼克兰NDSRIm/z值如下：
·分析样品中伐仑克林NDSRI峰的保留时间差异不得超过对照品溶液中相应伐仑克林NDSRI峰保留时间的2%。
整个方法相对简单明了，没有特殊的操作建议。这与活性成分的结构有关，也与得到的这类杂质本身的理化性质相关。杂质有紫外吸收，易离子化，不易挥发，对于方法开发来讲相对友好。遗憾FDA没有发表出方法的开发过程，也没有看到方法验证的操作。
因此对于这类亚硝基-药物成分相关杂质(NDSRI)的方法开发意义相对较小，但对于这类杂质的分析、定量和计算可以借鉴参考。
Ref.:FDA:LiquidChromatography-HighResolutionMassSpectrometry(LC-ESI-HRMS)MethodfortheDeterminationofVareniclineNitroso-DrugSubstanceRelatedImpurity(NDSRI)inChantix?DrugProductandVareniclineDrugSubstance..8
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