高效液相色谱仪测定牛可食性组织及牛奶中氮

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一、原理试料中残留的氮氨菲啶，用乙腈、甲酸铵-甲醇溶液提取，正己烷脱脂，高效液相色谱仪-串联质谱测定，外标法定量。二、试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T规定的一级水。2.1试剂2.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。2.1.2乙腈（CH3CN）：色谱纯。2.1.3甲酸（HCOOH）：色谱纯。2.1.4正己烷（C6H14）。2.1.5无水硫酸钠（Na2SO4）。2.1.6甲酸铵（HCOONH4）。2.2溶液配制2.2.10.25mol/L甲酸铵-甲醇溶液：取甲酸铵15.8g，用甲醇溶解并稀释至mL。2.2.20.1%甲酸溶液：取甲酸1.0mL，用水溶解并稀释至mL。2.2.%甲醇溶液：取甲醇mL，用水溶解并稀释至mL。2.2.4提取液：取乙腈和0.25mol/L甲酸铵-甲醇溶液按1：1（体积比）混匀。2.3标准品：盐酸氮氨菲啶，含量≥95.0%。2.4标准溶液的制备2.4.1标准贮备液：取氮氨菲啶标准品10mg，精密称定，于10mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1mg/mL的标准贮备液。-20℃以下保存。2.4.g/mL氮氨菲啶标准工作液：精密量取标准贮备液L，于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10g/mL的氮氨菲啶标准工作液。-20℃以下保存。2.4.3ng/mL氮氨菲啶标准工作液：精密量取10g/L的氮氨菲啶标准工作液1mL，于mL量瓶中，用80%甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为ng/mL的氮氨菲啶标准工作液。2～8℃保存。2.5材料：滤膜：0.22m。三、仪器和设备3.1高效液相色谱仪-串联质谱仪：配电喷雾离子源。3.2分析天平：感量0.g和0.01g。3.3漩涡振荡器。3.4振荡器。3.5组织匀浆机。3.6冷冻离心机。3.7旋转蒸发仪。3.8鸡心瓶：50mL。3.9离心管：50mL。四、测定步骤4.1提取：称取试料5g（准确至±20mg），于50mL离心管中，加无水硫酸钠2g，再加提取液10mL，涡旋混匀，振荡5min，r/min离心10min，取上层液于鸡心瓶中。残渣中加提取液10mL重复提取一次，合并两次提取液于鸡心瓶中，于45℃水浴旋转蒸发至干。备用。4.2净化：加80%甲醇溶液2mL于鸡心瓶中，充分涡旋溶解残余物，加正己烷2mL振荡混合1min，转移至10mL离心管中，r/min离心5min，弃上层正己烷液。再加正己烷2mL，重复提取一次。取下层清液，滤过，供高效液相色谱仪-串联质谱测定。4.3基质匹配标准曲线的制备精密量取ng/mL氮氨菲啶标准工作溶液或10g/mL氮氨菲啶标准工作溶液适量，于经提取、蒸干后的空白试料残余物中，用适量80%甲醇溶液溶解并稀释至2.0mL，使氮氨菲啶浓度为20、50、、、、ng/mL，滤过，制成系列基质匹配标准工作溶液，供高效液相色谱仪-串联质谱仪测定。以特征离子峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。4.4测定4.4.1高效液相色谱仪条件a）色谱柱：BEHC18(mm×2.1mm，1.7m)，或相当者；b）柱温：30℃；c）流速：0.2mL/min；d）进样量：10L；e）流动相：A+B=50+50，其中A相为乙腈（含0.1%甲酸），B相为水（含0.1%甲酸）。4.4.2质谱条件a）电离模式：ESI；b）扫描方式：正离子扫描；c）检测方式：多反应检测；d）电离电压：2.8kV；e）源温：℃；f）雾化温度：℃；g）锥孔气流速：50L/h；h）雾化气流速：L/h；i）驻留时间：0.3s；j）定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞电压见表1。4.4.3测定法取试样溶液和相应的基质匹配标准溶液，作单点或多点校准，按外标法计算。基质匹配标准溶液及试样溶液中氮氨菲啶的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。试样溶液中的离子相对丰度与基质匹配标准溶液中的离子相对丰度相比，符合表2的规定。在上述高效液相色谱仪-质谱条件下，氮氨菲啶基质匹配标准溶液特征离子质量色谱图见附录A。五、结果计算和表述试料中氮氨菲啶的残留量按式（1）计算：…………………………………………（1）式中:X—供试试料中氮氨菲啶的残留量，单位为微克每千克（g/kg）；Cs—基质匹配标准溶液中氮氨菲啶的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；As—基质匹配标准溶液中氮氨菲啶的峰面积；A—试样溶液中氮氨菲啶的峰面积；V—溶解残余物所用溶液体积，单位为毫升（mL）；m—供试试料质量，单位为克（g）。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字

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