纤维素酶CL活性检测试剂盒可见分光

纤维素酶（CL）活性检测试剂盒（可见分光光度法）

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

产品货号：BA

产品规格：50管/24样

产品内容：

提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体4mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体10mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：液体13mL×1瓶，4℃保存；

标准品：粉剂×1支，4℃保存，含10mg无水葡萄糖（干燥失重0.2%），临用前加入1mL蒸馏水溶解，配制成10mg/mL葡萄糖溶液备用，4℃可保存1周，或者用饱和苯甲酸溶液溶解，可保存更长时间。

标准品准备：将标准品用蒸馏水稀释至1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0mg/mL。

产品说明：

CL（EC3.2.1.4）存在于细菌、真菌和动物体内，能够催化纤维素降解，是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。采用3.5－二硝基水杨酸法测定CL催化纤维素降解产生的还原糖的含量

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样品测定的准备：

1、细菌或细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每万细菌或细胞加入1mL提取液，超声冰浴破碎细菌或细胞（功率20％，超声3S秒，间隔10S，重复30次）；g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：称取约0.1g组织加入1mL提取液，冰浴中匀浆。g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、加样表和测定步骤：

混匀，nm处蒸馏水调零，测定吸光值A，样品管计算ΔA=A测定管-A对照管。

标准曲线的建立：nm处以标准管0mg/mL调零，读标准管吸光值A。以浓度（y）为纵坐标，吸光度A（x）为横坐标建立标准曲线。

CL活力计算：

根据标准曲线，将ΔA带入公式中（x）计算样品浓度y（mg/mL）。

1、按照蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。

CL活力（U/mgprot）＝×y×V反总÷（V样×Cpr）÷T=×y÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。

CL活力（U/g鲜重）＝×y×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T=×y÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。

CL活力（U/cell）＝×y×V反总÷（×V样÷V样总）÷T=0.×y

：1mg/mL=μg/mL；V反总：反应体系总体积，0.35mL；V样：加入样本体积，0.05mL；

V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；：细菌或细胞总数，万。

ADH测定操作：

1、分光光度计预热30min，调节波长到nm，蒸馏水调零。

2、试剂二在25℃水浴中保温30min。

3、空白管：在1mL石英比色皿中依次加入μL蒸馏水、μL试剂二和μL试剂四，迅速混匀后于nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。△A空白管=A1-A2。

4、测定管：在1mL石英比色皿中依次加入μL上清液、μL试剂二和μL试剂四，迅速混匀后于nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A3和A4。△A测定管=A3-A4。

注意：空白管只需测定一次。

计算公式：

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。

ADH(μmol/min/mgprot)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×]÷(Cpr×V样)÷T=1.61×(△A测定管–△A空白管)÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。

ADH(μmol/min/g)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×]÷(W×V样÷V样总)÷T=1.61×(△A测定管–△A空白管)÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每个细胞每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。

ADH(μmol/min/cell)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=1.61×(△A测定管–△A空白管)÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。

ADH(μmol/min/mL)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×]÷V样÷T=1.61×(△A测定管–△A空白管)

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，μL=0.L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，μL=0.1mL；T：反应时间，1min。

注意事项：

1、上清液蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。

2、配制好的试剂二3天使用完。