邻 二2 己基酯暴露通过H

背景

邻 二酯（DEHP）是一种广泛使用的增塑剂，已被证明会导致人类和模型动物的生殖功能障碍。然而，DEHP暴露导致睾丸损伤的确切机制尚未完全阐明。使用气相色谱-质谱法，本研究发现DEHP暴露后，小鼠血清中的MEHP和DEHP浓度升高。使用RNA-seq，发现青春期前DEHP暴露导致的睾丸损伤可能与铁死亡和HIF-1信号通路有关。随后的免疫印迹、亚铁和丙二醛测量以及睾丸切片的免疫荧光都证实了RNA-seq的发现。进一步的实验也证实了睾丸间质细胞和支持细胞的铁死亡。通过Westernblot、细胞免疫荧光和芯片qPCR，发现MEHP暴露导致HIF-1α积累和稳定，导致HIF-1α易位到细胞核中，并在睾丸间质和支持细胞中诱导HIF-1α/Hmox1结合。在使用CRISPR/Cas9技术剔除HIF-1α后发现Hif-1α基因敲除抑制了MEHP诱导的铁死亡。

结果

DEHP暴露导致青春期前睾丸细胞损伤。

雄性小鼠在青春期前口服DEHP两周。DEHP暴露以剂量依赖性方式导致睾丸损伤.DEHPmg/kg/天生精小管没有明显损伤，而DEHPmg/kg/天肾小管管腔中的生殖细胞脱落，D组（DEHPmg/kg/天）的生精小管组织紊乱。并且D和D组的生精小管层较少。D组的睾丸器官系数显著降低。GO分析显示DEG富含氧化应激和铁代谢相关的GO术语（图1C）。KEGG分析显示DEGs在铁死亡途径和与铁死亡密切相关的谷胱甘肽代谢途径（图1D）。在DEHP暴露后，如Acsl4、Ftl1、Trf和Atg5等铁调基因上调，Gpx4表达下调。GSEA表明HIF-1信号通路及其上游PI3K-AKT信号通路上调（图1F，G）。此外Hif-1α在热图中也是上调（图1E）。总之，青春期前接触DEHP会导致睾丸损伤，这可能涉及铁死亡和HIF-1信号通路。

图1

青春期前DEHP暴露导致小鼠睾丸铁死亡。

青春期前接触DEHP会导致小鼠睾丸中亚铁离子含量升高。MDA作为脂质 化的生物标志物，其含量升高。因此DEHP暴露显著增强小鼠睾丸中的脂质 化。此外，对铁蛋白进行了Westernblot。发现，DEHP暴露后，ACSL4、FTH1、HO-1和SLC7A11的表达呈剂量依赖性上调，GPX4表达下调（图2C）。此外，进行了睾丸切片检查。与WESTERNBLOT（图2C）一致，发现基于IF切片的生精小管中HIF-1α表达也上调（图2D）。间质细胞中HIF-1α的表达也增加（图2D）。这些结果共同表明，小鼠睾丸铁死亡是青春期前DEHP暴露的结果。

图2

MEHP对睾丸间质细胞和支持细胞造成的细胞损伤。

通过浓度梯度测定细胞活力，与对照组相比，经μMMEHP处理的TM3睾丸间质细胞和TM4睾丸支持细胞的存活率下降至80–90%（图3A，G）。因此，在随后的所有实验中，本研究都用μMMEHP处理两种细胞系。此外，钙 绿素AM/PI染色（图3B，H）表明MEHP暴露加速了TM3间质细胞和TM4支持细胞的死亡。在TM3/4睾丸间质细胞中，GO分析显示DEGs氧化应激和铁稳态富集（图3C）。KEGG分析显示DEGs在铁死亡和HIF-1信号通路中富集（图3D）。GSEA表明DNA复制途径受到抑制（图3E），谷胱甘肽代谢途径增强（图3F）。所以MEHP暴露诱导睾丸间质细胞和支持细胞死亡。细胞性铁死亡和HIF-1信号通路激活可能是其潜在机制。

图3

MEHP暴露诱导睾丸间质和支持细胞铁死亡。

使用H2DCFDA探针，发现MEHP暴露于睾丸间质细胞和支持细胞后，细胞ROS显著增加（图4a，G）。在对睾丸间质细胞和支持细胞中的铁死亡基因进行了qPCR。发现，在MEHP暴露后，Hmox1、Acsl4、Fth1、Gclc、Gclm和Slc7a11的表达上调，Gpx4的表达下调（图4B，H）。MEHP暴露后，睾丸间质细胞和支持细胞中也出现亚铁离子和MDA显著增多（图4C，I）。Westernblot发现HO-1、ACSL4、FTH1和SLC7A11的表达上调，而GPX4的表达下调（图4E，K）。睾丸间质细胞和支持细胞的线粒体形态异常，线粒体嵴减少，外膜致密（图4F，L）。这些结果表明，MEHP暴露诱导睾丸间质细胞和支持细胞的铁死亡。

图4

使用铁抑素-1抑制MEHP诱导的铁死亡。

MEHP暴露显著降低了睾丸间质细胞和支持细胞的活力（图5a，G）。铁螯合剂DFO和铁死亡抑制剂fer-1的使用抑制了细胞活力的降低。然而，坏死性死亡抑制剂nec-1和凋亡抑制剂Z-VAD都不能改善MEHP暴露后两种细胞的存活率降低。在两种细胞系中使用fer-1可以挽救亚铁超载（图5b，H）、脂质 化（图5c，I）和细胞ROS爆发（图D，J）。钙 绿素AM/PI染色显示出相似的结果（图5E，K）。Westernblot（图5F，L）显示，在MEHP暴露后，fer-1恢复了ACSL4、FTH1、HO-1和SLC7A11的上调，以及GPX4的下调。这些结果表明，fer-1通过抑制睾丸间质细胞和支持细胞的铁死亡而保护MEHP诱导的细胞死亡。

图5

HIF-1α通过与Hmox1启动子区域结合来调节Hmox1转录。

发现编码PHD的Egln1和Egln3在MEHP暴露后下调（图6a，G）。PHD复合物通常会降解HIF-1α，这表明HIF-1α可能会积累和稳定。RT-qPCR显示，MEHP暴露后，睾丸间质细胞和支持细胞中Hif-1α和Hif-1β的表达上调，Egln1、Egln2和Egln3的表达下调（图6B，H）。Westernblot也表达出类似的结果（图6c，I）。PHD复合物被抑制。一旦激活，HIF-1α可以转移到细胞核中，并作为转录因子发挥作用。使用细胞IF，在MEHP暴露后HIF-1α易位到细胞核中（图6E，K）。睾丸间质（图6D，E）和支持细胞（图6J，K）中HIF-1β的核移位。MEHP暴露后，核HIF-1α的表达上调，但细胞质HIF-1α表达下调（图6D，J）。因为亚铁是HO-1的主要催化物，因此HO-1上调可能导致亚铁超载。HO-1（由Hmox1编码）是HIF-1信号通路的关键下游分子。ChIP-qPCR鉴定HIF1α可以结合Hmox1的启动子，这种结合是由MEHP暴露诱导的（图6F，L）。总之，MEHP暴露导致HIF-1α积累和稳定，使得HIF-1α易位到细胞核中，并在睾丸间质和支持细胞中诱导HIF-1/Hmox1结合。

图6

HIF-1α基因敲除抑制MEHP诱导的铁死亡。

两种细胞系Hif-1α敲除后，MEHP暴露下受损的细胞活力得到改善。同时，Hif-1α敲除后脂质 化（图7b，I）和亚铁超载（图7c，J）也受到抑制。分别使用qPCR和Western印迹法评估Hmox1和HO-1水平的表达。Hif-1α敲除抑制了MEHP暴露引起的Hmox1（图7d，K）和HO-1水平（图7g，N）的上调。此外，MEHP暴露后ROS爆发（图7E，L）和细胞死亡（图7F，M）也在Hif1α敲除后减弱。Hif-1α敲除恢复了ACSL4、FTH1和SLC7A11的上调，以及GPX4的下调（图7G，N）。总的来说，这些结果表明，MEHP暴露以HIF-1α依赖的方式导致睾丸间质细胞和支持细胞的铁死亡。

图7

示意图

青春期前DEHP暴露通过HIF-1α/Hmox1信号通路导致小鼠睾丸铁死亡。暴露于MEHP（DEHP在体内的主要生物代谢产物）会抑制PHD，导致HIF-1α积累和稳定，导致HIF-1α易位到细胞核中，并在睾丸间质和支持细胞中诱导HIF-1/Hmox1结合。因此，HO-1表达显著上调。HO-1的过度表达导致亚铁超载、ROS积累，最终导致铁死亡。

总结

本研究首次发现青春期前DEHP暴露通过一种新机制导致小鼠睾丸铁死亡。证明HIF-1α通过提高HO-1表达水平介导MEHP诱导的铁死亡。通过抑制MEHP诱导的HO-1上调，敲除Hif-1α成功抑制了铁死亡。这些发现表明，青春期前DEHP暴露通过HIF-1α/HO-1信号通路导致小鼠睾丸铁死亡。HIF-1α是哺乳动物细胞适应缺氧的主要调节因子。因此，HIF-1信号通路可通过ROS的积累和PI3K-AKT信号通路的激活而不是缺氧触发，从而响应DEHP暴露。本研究发现，铁超载引起的上铁症，HIF-1α活化可诱导HO-1上调。Hif-1α敲除后，铁超载和HO-1上调均发生逆转。因此，这些结果提示，由于DEHP暴露，HO-1上调可能加重氧化应激，导致小鼠睾丸亚铁的过度地升高。本研究的局限性。首先，只给小鼠三种浓度的DEHP（即mg/kg/天、Dmg/kg/天和Dmg/kg/天）进行治疗。小鼠大剂量DEHP暴露可能与人类实际DEHP暴露水平不相等，因此DEHP暴露的潜在机制和 性可能不同。因此，为了研究DEHP对人体睾丸的 性，有必要进一步研究低剂量DEHP暴露的动物模型，其与人体实际接触和代谢更接近。其次，为了估计DEHP暴露所致睾丸损伤的潜在机制，只从D和对照组发送睾丸RNA序列，因此，无法根据不同浓度DEHP暴露进行时间序列表达分析。HIF-1α还可以调节其它基因，如Tf和Tfrc。然而，DEHP是否能通过HIF-1α/TF或HIF-1α/TFRC信号通路诱导小鼠睾丸上铁死亡，尚需进一步研究。 ，在本研究中研究了Leydig和Sertoli细胞，但是DEHP暴露是否会导致生殖细胞的类似损伤，目前尚不清楚。